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      1. English

        食品微生物检验GB4789.5-2012 志贺氏菌检验及注意事项

        发布时间:2020-11-18      浏览次数:5391    分享:

        一、志贺氏菌的生物学特性

        生物学特性:志贺氏菌属细菌为革兰氏阴性短杆菌,长约2~3μm,宽0.5~0.7μm,无芽胞,无荚膜,无鞭毛,有菌毛,不运动;需氧或兼性厌氧,对营养要求不高,在普通培养基(如营养琼脂)上即能生长;最适生长温度35~37℃,适宜pH为6.4~7.8。发酵糖类产酸不产气(福氏和鲍氏志贺菌中的某些血清型偶可产生少量气体)。分为4个群:A群(痢疾志贺氏菌)、B群(福氏志贺氏菌)、C群(鲍氏志贺氏菌)、D群(宋内氏志贺氏菌)。

        流行学特征:志贺氏菌产生强烈的内毒素(endotoxin,ET),是一种脂多糖和脂蛋白复合物,为志贺氏菌致病的重要致病因素。A群志贺氏菌Ⅰ型能产生一种毒性极强的细菌外毒素称为志贺毒素(Shigatoxin,Stx),与感染者中毒性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒症等严重并发症的发生密切相关,其毒性可表现为神经毒性、细胞毒性和肠毒性。在我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。 病人和带菌者是细菌性痢疾的传染源,由于饮食从业人员的带菌,可以使食品污染而造成食物型爆发。由于污水渗入供水系统,也常造成水型的爆发。

        二、志贺氏菌的检验

        三、培养基原理解析

        1. 志贺氏菌增菌肉汤培养基

        ?培养基中除胰蛋白胨、葡萄糖外,加入新生霉素作抑菌剂,并加入少量的吐温80作增溶剂,以帮助样品的充分分散。

        ?41℃厌氧培养有助于抑制其它杂菌生长。

        2. 麦康凯琼脂培养基(MAC)

        ?利用胆盐来抑制革兰氏阳性细菌的生长;利用乳糖发酵,中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区分开。

        ?志贺氏菌呈无色菌落,半透明,光滑,湿润,圆形,边缘整齐或不齐。

        麦康凯琼脂培养(MAC)

        3.木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐(XLD)琼脂培养基

        ?脱氧胆酸钠可以抑制革兰氏阳性细菌和部分大肠杆菌,多数志贺氏菌不能发酵木糖,木糖的添加可将志贺氏菌与其它菌株区别开来,因此,志贺氏菌在XLD平板上呈现无色菌落,但少数发酵木糖的志贺氏菌在此平板上会被漏检,XLD平板对宋内志贺氏菌亦有轻度抑制作用。

        ?志贺氏菌通常呈粉红色至无色,半透明,光滑,湿润,圆形,边缘整齐或不齐菌落。

        木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐(XLD)琼脂菌落特征

        4.志贺氏菌显色培养基

        ?利用非志贺氏菌的特异性的酶,使其与酶底物结合形成不同颜色的菌落,而生化特性反应不活跃的志贺氏菌经22~28h培养后,则形成易于识别的白色-粉红色(与培养基颜色相近)的菌落。

        ?志贺氏菌呈白色/清晰的菌落,大小约为1~3mm,周围培养基变红。

        5.三糖铁琼脂培养基

        ?该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1,只能利用葡萄糖的细菌,葡萄糖被分解产酸使斜面先变黄,但因量少,生产的少量酸。因接触空气而氧化,加之细菌生长利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故斜面后来又变红。底部由于厌氧状态,酸类不被氧化,仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌,则产生大量的酸,使整个培养基呈黄色。另外,因某些细菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氢,硫化氢和培养基中的铁盐反应生成黑色的硫化亚铁沉淀。

        三糖铁

        6.靛基质试验

        ?某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。

        ?结果判读:阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色; 阴性为滴加试剂后不变红色。

        靛基质试验

        7.尿素酶试验

        ?具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素,产生大量的氨,使培养呈碱性,酚红指示剂在pH6.8时呈黄色,pH8.1呈粉红色。

        ?结果判读:阳性为玫红色; 阴性为淡橙红色-淡黄色。

        尿素酶试验

        8.赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验

        ?具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培养基变碱,使指示剂显示出来。

        ?结果判读:阳性为试验管为绿色-蓝绿色,对照管变黄色; 阴性为试验管和对照管均变黄色,或均不变色。

        赖氨酸脱羧酶试验阳性

        9.糖(醇)发酵试验

        ?绝大多数细菌都能利用糖(醇)类作为碳源和能源,但是它们在分解糖(醇)的能力上有很大的差异,有些细菌能分解某种糖(醇)并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。

        ?(指示剂为溴甲酚紫)结果判读:阳性为变黄色; 阴性为紫色。

        甘露醇发酵试验

        10.β-半乳糖苷酶

        ?某些细菌可产生b-半乳糖苷酶,能分解邻硝基酚-b半乳糖苷(ONPG),生成黄色的邻硝基酚。

        ?结果判读:阳性为黄色; 阴性为不变色-淡黄色。

        ONPG生化管

        11.  葡萄糖铵试验

        ?鉴别细菌利用铵盐作为唯一氮源并分解葡萄糖的试验。溴麝香草酚蓝是指示剂,产酸时培养基由绿色变黄色。

        ?结果判读:阳性为黄色; 阴性为绿色。

        葡糖糖铵利用试验

        12.  西蒙氏柠檬酸盐培养基

        ?细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源,能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长,分解柠檬酸盐生成碳酸钠,使培养基变碱性。

        ?结果判读:阳性为蓝绿-蓝色; 阴性为绿色。

        西蒙氏柠檬酸盐培养基试验

        13.  粘液酸盐试验

        ?某些细菌能利用粘液酸盐,分解产酸,使培养基中的溴麝香草酚蓝变黄色。

        ?结果判读:阳性为黄色; 阴性为绿色-蓝绿色。

        粘液酸盐试验

        四、志贺氏菌的生化鉴定

        生化反应

        A群:痢疾志贺氏菌

        B群:福氏志贺氏菌

        C群:鲍氏志贺氏菌

        D群:宋内氏志贺氏菌

        ?-半乳糖苷酶

        -a

        -a

        尿素

        赖氨酸脱羧酶

        鸟氨酸脱羧酶

        -b

        水杨苷

        七叶苷

        靛基质

        -/+

        (+)

        -/+

        甘露醇

        +c

        棉子糖

        甘油

        (+)

        (+)

        d

        注:+表示阳性;-表示阴性;-/+表示多数阴性;+/-表示多数阳性;(+)表示迟缓阳性;d表示有不同生化型。

        a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。

        b鲍氏13型为鸟氨酸阳性。

        c福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。

        ?附加生化鉴定

        ?由于某些不活泼的大肠埃希氏菌(anaerogenic E.coil.)、A-D(碱性-异型Alkalescens-D isparbiotypes)菌的部分生化特征与志贺氏菌相似,并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集。需要进一步做葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24 h~48 h)。

        生化反应

        A群:痢疾志贺氏菌

        B群:福氏志贺氏菌

        C群:鲍氏志贺氏菌

        D群:宋内氏志贺氏菌

        大肠埃希氏菌

        A-D菌

         

        葡萄糖铵

        西蒙氏柠檬酸盐

        d

        d

        粘液酸盐

        d

        d

        注1:+表示阳性;-表示阴性;d表示有不同生化型。

        注2:在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性,而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D(碱性-异型)菌至少有一项反应为阳性。

         

        五、志贺氏菌的血清诊断

        ?志贺氏菌属没有动力,所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体(O)抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。

        ?一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原

        ?在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取一环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。

        ?再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min,并对着黑色背景进行观察,如果抗血清中出现凝结成块的颗粒,而且生理盐水中没有发生自凝现象,那么凝集反应为阳性。

        ?如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征,而其血清学试验为阴性的话,可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液,100℃煮沸15 min~60 min去除K抗原后再检查。

        六、所需培养基试剂

        用途

        货号

        名称

        规格

        增菌

        023141

        志贺氏菌增菌肉汤

        瓶(干粉)250g

        SR0380

        志贺氏菌增菌肉汤配套试剂(新生霉素)

        盒(西林瓶)10支/盒

        CP0730

        志贺氏菌增菌肉汤(需加配套试剂)

        盒(袋装)225 mL×10袋

        平板分离

        029999

        木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

        瓶(干粉)250g

        029999P1

        木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

        瓶(颗粒)250g

        CP0180

        木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

        盒(平板)90 mm×20

        022144

        麦康凯琼脂

        瓶(干粉)250g

        024076

        麦康凯琼脂培养基平板

        盒(平板)90 mm×20

        CRM011

        志贺氏菌显色培养基

        1000mL

        CRM011A

        志贺氏菌显色琼脂平板

        盒(平板)90 mm×20

        生化鉴定

        022080

        三糖铁琼脂(TSI)

        瓶(干粉)250g

        CP0080

        三糖铁斜面

        盒(管装)20支

        026050

        半固体琼脂

        瓶(干粉)250g

        075350A

        半固体琼脂

        盒(管装)20支

        CP0150

        营养琼脂

        盒(管装)20支

        024089

        营养琼脂平板

        盒(平板)90 mm×20

        022020

        营养琼脂

        瓶(干粉)250g

        022020P1

        营养琼脂(NA)

        瓶(颗粒)250g

        023090

        尿素琼脂培养基基础

        瓶(干粉)100g

        029100

        40%无菌尿素溶液

        盒(西林瓶)10支/盒

        生化鉴定

        075150

        尿素(冻干)

        盒(西林瓶)10支/盒

        075280

        赖氨酸脱羧酶培养基

        盒(西林瓶)20支/盒

        075270

        L-鸟氨酸脱羧酶培养基

        盒(西林瓶)20支/盒

        075290

        氨基酸脱羧酶对照培养基

        盒(西林瓶)20支/盒

        029110

        无菌石蜡油

        10 mL×1支

        075180

        β-半乳糖苷ONPG

        盒(西林瓶)20支/盒

        075140

        水杨素(水杨苷)

        盒(西林瓶)20支/盒

        075160

        七叶灵(七叶苷)

        盒(西林瓶)20支/盒

        075040

        甘露醇

        盒(西林瓶)20支/盒

        075230

        D-棉籽糖

        盒(西林瓶)20支/盒

        生化鉴定

        022110

        蛋白胨水(靛基质培养基,色氨酸肉汤)

        瓶(干粉)100g

        075240

        蛋白胨水(靛基质培养基,色氨酸肉汤)

        盒(西林瓶)20支/盒

        029230

        靛基质试剂

        10 mL×1支

        075840

        甘油发酵管

        盒(西林瓶)20支/盒

        075260

        葡萄糖铵

        盒(西林瓶)20支/盒

        023150

        葡萄糖铵培养基

        瓶(干粉)250g

        075200

        西蒙氏柠檬酸盐

        盒(西林瓶)20支/盒

        022120

        西蒙氏柠檬酸盐培养基

        瓶(干粉)250g

        075521

        粘液酸盐测试肉汤

        盒(西林瓶)20支/盒

        075522

        粘液酸盐质控肉汤

        盒(西林瓶)20支/盒

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