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      1. English

        GB4789-40-2016 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验及其注意事项

        发布时间:2021-11-22      浏览次数:155    分享:

        克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的生物学特性


        生物学特性:克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)是人和动物肠道内寄生的一种有周生鞭毛,能运动,兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。

        流行学特征:广泛分布于食品和环境中,是一种条件致病菌,偶尔可引起菌血症、脑膜炎、大脑炎和坏死性小肠结肠炎。虽然克罗诺杆菌属可引起各年龄段的感染,但高危人群主要是婴儿。大量研究发现配方奶粉是婴幼儿感染的主要途径,婴儿配方奶粉中微量的克洛诺杆菌属(<3CFU/100g)污染也能导致感染的发生。


        克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检验


        定性检验-操作注意事项

              1:处理正常样品时,处于室温(25℃左右)的缓冲蛋白胨水无需预热至44 ℃ ,即可快速融化婴幼儿配方奶粉;
              2:增菌培养后的BPW和mLST-Vm肉汤必须混浊后,再进行下一步操作;
              3:每个样品必须同时分别划线接种两个阪崎肠杆菌显色平板,以避免只划线一个,降低检出率;
              4:培养箱中叠放培养皿时,为防止中间平皿过热,高度不得超过6个平板;
              5:mLst-Vm要求44 ℃培养,温度波动<0.5 ℃;
              6:高压灭菌后,培养基中的琼脂往往会分层在底部,应摇匀后使用。

        定量检验-操作注意事项
              1:注意检验样品数量变化;
              2:其他注意事项同定性检验的。

        培养基原理解析

        改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素
              胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;氯化钠可维持均衡的渗透压;乳糖是大肠菌群可发酵的糖类;磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂;月桂基硫酸钠和万古霉素可抑制革兰氏阳性细菌的生长。

        阪崎肠杆菌显色培养基
              蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;胆盐抑制革兰氏阳性菌,氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生;显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-ɑ-D 葡萄糖苷与阪崎肠杆菌中的α-葡萄糖苷酶发生反应,水解底物,释放出5-溴-4-氯-3-吲哚基显色基团,在淡黄色平板上产生绿-蓝绿色的菌落。

        克罗诺杆菌属的主要生化特征

        生化试验特征
        黄色素产生+
        氧化酶-
        L-赖氨酸脱羧酶-
        L-鸟氨酸脱羧酶(+)
        L-精氨酸双水解酶+
        柠檬酸水解(+)
        发酵D-山梨醇(-)
        L-鼠李糖+
        D-蔗糖+
        D-蜜二糖+
        苦杏仁苷+
        注:+>99%阳性;->99阴性;(+)90%~99%阳性;(-)90%~99%阴性。

        生化鉴定原理解析


        氧化酶试验
        原理:氧化酶使细胞色素C氧化,氧化型细胞色素C再氧化对苯二胺试剂形成紫色复合物,产生颜色反应。
        操作:滴加1滴氧化酶试剂到一小块洁净滤纸上,用玻棒或接种环(铂或塑料)挑取适量新鲜菌苔涂在试剂润湿的纸片上;30秒内出现蓝紫色为阳性,延迟反应或无颜色变化为阴性。

        柠檬酸水解试验
        当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源,同时利用柠檬酸盐作为唯一的碳源时,可在柠檬酸盐培养基上生长,分解柠檬酸钠,生成碳酸钠,使培养基产碱变蓝色。
        结果判读:阳性为培养基变为蓝色;阴性为培养基不变色。

        氨基酸相关试验(鸟氨酸脱羧酶+赖氨酸脱羧酶+精氨酸双水解酶)
        具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(如:鸟氨酸→腐胺)和二氧化碳,使培养基变碱,通过指示剂显示出来。
        精氨酸双水解酶试验采用培养基与氨基酸脱羧酶试验相同,精氨酸经过两步水解生成有机胺和无机氨,使培养基变碱,通过指示剂显示出来。
        结果判读:阳性为试验管为绿色-蓝绿色,对照管变黄色;  阴性为试验管和对照管均变黄色,或均不变色。

        苦杏仁苷
        蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、矿物质;氯化钠维持均衡的渗透压;较少量的琼脂作为培养基的凝固剂。
        测试菌有动力的话,就会沿穿刺线扩散生长,无动力就不会扩散生长。

        糖(醇)发酵试验
        绝大多数细菌都能利用糖(醇)类作为碳源和能源,但是它们在分解糖(醇)的能力上有很大的差异,有些细菌能分解某种糖(醇)并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。
        (指示剂为溴甲酚紫)结果判读:阳性为变黄色;  阴性为紫色。

        质量控制及疑难解析


        1: 实验室过程中,每批样品都要做空白对照。若空白对照平板上出现菌落,应废弃本次实验结果,并对稀释液、平皿、培养基、实验环境等进行污染来源分析。

        2: 为控制环境污染,可在检验过程中,与检验工作台上打开两块阪崎肠杆菌显色平板,并在检验环境中暴露不少于15分钟,将此平板与本批次样品同时培养,以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。

        3:每2个月将所使用的培养基和生化试剂用阪崎肠杆菌菌的标准菌株或阴性菌株)进行验证,并进行记录。

        疑难解析

        Q1: TSA上有的菌落不能确定是否有黄色色素产生怎么办?
              部分克洛诺杆菌不能产生明显黄色色素,在试验中应选择阴性对照(白色菌落)大肠埃希氏菌ATCC25922,以避免漏检。此外,亦可把菌落挑取至白纸上观察菌落颜色。

        Q2:通常情况下,每个平皿培养基使用量是多少?培养基体积变化是否会影响实验结果?
              一般情况下每平皿培养基用量约为15~20ml,检验阪崎肠杆菌黄色色素需在TSA平板上培养48h±4h,建议使用体积达20ml左右,以避免培养48h后,菌落干燥,影响鉴定结果。

        所需培养基试剂


        用途货号名称规格
        增菌023130缓冲蛋白胨水(BPW)瓶(干粉) 250g
        023130P1缓冲蛋白胨水(BPW)瓶(颗粒) 250g
        022212改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)基础(MLST)瓶(干粉) 250g
        SR0180万古霉素(改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤配套试剂)盒(西林瓶) 10支/盒
        CP0750改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST-Vm)盒(管装)
        平板分离CRM006阪崎肠杆菌显色培养基(DFI)1000ml
        CRM006B阪崎肠杆菌显色培养基(DFI)平板盒(平板) 90 mm×20
        028077胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)瓶(干粉) 250g
        028074A胰酪大豆胨琼脂培养基(大豆酪蛋白琼脂培养基)平板盒(平板) 90 mm×20
        生化鉴定029170氧化酶试剂瓶(干粉) 250g
        075280赖氨酸脱羧酶盒(西林瓶) 20支/盒
        075270鸟氨酸脱羧酶盒(西林瓶) 20支/盒
        075290氨基酸脱羧酶(对照培养基)盒(西林瓶) 20支/盒
        075590精氨酸双水解酶盒(西林瓶) 20支/盒
        075600精氨酸双水解酶对照盒(西林瓶) 20支/盒
        075200西蒙氏柠檬酸盐盒(西林瓶) 20支/盒
        075090山梨醇盒(西林瓶) 20支/盒
        075110鼠李糖盒(西林瓶) 20支/盒
        075050蔗糖盒(西林瓶) 20支/盒
        075560蜜二糖盒(西林瓶) 20支/盒
        075880苦杏仁苷盒(西林瓶) 20支/盒

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