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      1. English

        GB4789-6-2016 致泻大肠埃希氏菌检验及注意事项

        发布时间:2021-11-26      浏览次数:114    分享:

        致泻大肠埃希氏菌生物学特性


        致泻大肠埃希氏菌:一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可经过污染食物引起人类发病亚娱体育最新网址|官方版。
        大肠埃希氏菌为革兰氏阴性短小杆菌亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,分类学上属于肠杆菌科大肠埃希氏菌属亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。
        常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌EPEC、肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC亚娱体育最新网址|官方版、产肠毒素大肠埃希氏菌ETEC亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版、产志贺毒素大肠埃希氏菌STEC(包括肠道出血性大肠埃希氏菌EHEC)和肠道集聚性大肠埃希氏菌EAEC亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        致泻大肠埃希氏菌检验程序


        操作注意事项
              1:对易产生较大颗粒的样品(如肉类)进行检测时,建议使用带滤网均质袋亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,以便均质后用吸管吸取匀液亚娱体育最新网址|官方版;
              2:取前增菌液接种肠道菌增菌肉汤后需在42±1 ℃温度下进行培养,该温度范围内培养有助于抑制非肠道菌生长亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版;
              3:分离划线用直径3mm的接种环(1环约10微升);
              4:可疑菌落的选取,应是每个琼脂平板上分别取10~20个(10个以下的全蜒怯樘逵钚峦穦官方版。┤樘欠⒔秃筒环⒔偷木?;
              5:在TSI培养时亚娱体育最新网址|官方版,应将试管口松开,保持管内有充足的氧气,否则由于氧气不足,斜面酸性产物不能氧化恢复红色亚娱体育最新网址|官方版。
              6:大肠埃希氏菌H抗原在传代中容易丢失或发育不良亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,需在半固体上传代3次,观察生长,如不扩散亚娱体育最新网址|官方版,则表示H抗原丢失,无法做H抗原凝集试验。

        培养基原理解析


        营养肉汤:
        胨和牛肉浸出粉提供氮源亚娱体育最新网址|官方版、维生素亚娱体育最新网址|官方版、氨基酸和碳源亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,氯化钠能维持均衡的渗透压亚娱体育最新网址|官方版,有利于损伤细菌的复苏亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        肠道菌增菌肉汤:
        蛋白胨提供蛋白质、维生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源;酸氢二钠和磷酸二氢钾为缓冲剂亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版;牛胆盐和煌绿为选择性抑菌剂亚娱体育最新网址|官方版,抑制非肠杆菌科细菌的生长亚娱体育最新网址|官方版。

        麦康凯琼脂(MAC):
        该培养基中含有牛胆盐和结晶紫亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,可抑制革兰氏阳性菌的生长亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈亚娱体育最新网址|官方版。
        分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色亚娱体育最新网址|官方版,培养基周围有胆盐沉淀环亚娱体育最新网址|官方版;不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。

        伊红美蓝琼脂(EMB):
        乳糖作为可发酵碳源亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,伊红和美蓝同时作为抑菌剂和指示剂,在酸性条件下亚娱体育最新网址|官方版,两者结合形成黑色沉淀并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红和美蓝比例相关亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。
        分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽亚娱体育最新网址|官方版;不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色亚娱体育最新网址|官方版。

        三糖铁琼脂:
        该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1亚娱体育最新网址|官方版,只能利用葡萄糖的细菌亚娱体育最新网址|官方版,葡萄糖被分解产酸使斜面先变黄,但因量少亚娱体育最新网址|官方版,生产的少量酸亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。因接触空气而氧化,加之细菌生长利用培养基中含氮物质亚娱体育最新网址|官方版,生成碱性产物,故斜面后来又变红亚娱体育最新网址|官方版。底部由于厌氧状态,酸类不被氧化亚娱体育最新网址|官方版,仍保持黄色亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。而发酵乳糖的细菌亚娱体育最新网址|官方版,则产生大量的酸亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,使整个培养基呈黄色。另外,因某些细菌能分解含硫氨基酸亚娱体育最新网址|官方版,生成硫化氢,硫化氢和培养基中的铁盐反应生成黑色的硫化亚铁沉淀。

        氰化钾利用试验
        氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌亚娱体育最新网址|官方版。
        结果判读:阳性为试验管和对照管都有生长变浑浊亚娱体育最新网址|官方版; 阴性为试验管澄清不见生长,对照管生长浑浊。

        靛基质试验
        某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚亚娱体育最新网址|官方版。吲哚的存在可用显色反应表现出来亚娱体育最新网址|官方版。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合亚娱体育最新网址|官方版,形成玫瑰吲哚亚娱体育最新网址|官方版,为红色化合物亚娱体育最新网址|官方版。
        结果判读:阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色;  阴性为滴加试剂后不变红色亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        尿素酶试验
        具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素亚娱体育最新网址|官方版,产生大量的氨亚娱体育最新网址|官方版,使培养呈碱性亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,酚红指示剂在pH6.8时呈黄色亚娱体育最新网址|官方版,pH8.1呈粉红色亚娱体育最新网址|官方版。
        结果判读:阳性为玫红色亚娱体育最新网址|官方版;  阴性为淡橙红色-淡黄色亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        生化试验结果判读 - 大肠埃希氏菌的生化特征


        生化项目结果
        三糖铁斜面产酸或不产酸亚娱体育最新网址|官方版,底层产酸亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,不产硫化氢
        尿素(pH7.2)阴性
        靛基质试验阴性
        KCN阴性

        取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验

        PCR确认试验 - 致泄大肠埃希氏菌特征基因


        PCR试剂盒检测流程


        致泻大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒特点


        致泻大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒亚娱体育最新网址|官方版,各试剂盒检测的对应特征性基因如下:

        试剂盒货号检测菌株类别检测基因组合
        KJD02P

        EPEC

        STEC

        EHEC

        uidA
        bfpB
        escV
        stx2
        stx1
        KJD03PEAECuidA
        pic
        aggR
        astA
        KJD04PETECuidA
        sth
        lt
        stp
        KJD05PEIECuidA
        invE

        形态组分名称规格×数量
        冻干型干粉试剂18管×3排
        干粉试剂2(EIEC除外)8管×3排
        液态复溶液1mL×1管
        冻干型阳性对照1管
        阴性对照

        1管ATCC25922

        DNA

        液态裂解液1 mL×1管
        裂解液1 mL×1管
        loading buffer240 μL×1管
        说明书1份

        血清学试验(选做项目)


        取PCR试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验亚娱体育最新网址|官方版。

        O抗原鉴定
        1)检查培养物有无自凝性:在洁净玻片上滴一滴生理盐水亚娱体育最新网址|官方版,用接种环蘸少许待测培养物亚娱体育最新网址|官方版,混合于生理盐水内,1分钟内无凝集现象亚娱体育最新网址|官方版,为无自凝亚娱体育最新网址|官方版,反之亚娱体育最新网址|官方版,有自凝性亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。
        2)假定性试验:先用大肠埃希氏菌O多价血清做玻片凝集亚娱体育最新网址|官方版,如果多价有凝集现象亚娱体育最新网址|官方版,再用多价所包含的单价O血清做试验,如与某一单价O血清有凝集反应亚娱体育最新网址|官方版,即为假定性试验阳性,反之为阴性亚娱体育最新网址|官方版。
        3)确证试验:测试培养物制成3号麦氏浊度菌悬液亚娱体育最新网址|官方版,与假定阳性的O单价血清(原效价1:160~1:320亚娱体育最新网址|官方版,0.5%盐水稀释至1:40)等量混合亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,放50±1 ℃亚娱体育最新网址|官方版,培养16h亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,观察结果亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,如凝集,可证实为该O抗原亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        H抗原鉴定
        先穿刺半固体亚娱体育最新网址|官方版,有动力再做H抗原鉴定亚娱体育最新网址|官方版。

        质量控制及疑难解析


        质量控制
              1: 为了控制环境污染亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,每次检验过程中亚娱体育最新网址|官方版,于检验台上打开两块计数琼脂平板亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,并在检验环境中暴露不少于15分钟,将此平板与本批次样品同时进行培养亚娱体育最新网址|官方版,以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
               2: 定期使用致泻大肠埃希氏菌标准菌株或相应定量活菌参考品亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,在P2实验室或阳性对照实验室内亚娱体育最新网址|官方版,用适当的食品样品进行阳性实验验证亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,染菌量应控制在10~100CFU/25g,并进行记录亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,次验证实验至少每2个月进行1次亚娱体育最新网址|官方版。
               3:可以使用全自动或半自动的核酸提取仪提取DNA亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,但必须经过验证后使用亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。
               4:每次PCR应使用EPEC EIEC ETEC STEC/EHEC EAEC标准菌作为阳性对照亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。同时使用大肠埃希氏菌ATCC25922或等效标准菌株作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照亚娱体育最新网址|官方版,控制PCR污染体系亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        疑难解析

        Q1:仅用毒力基因检测就能对致泻大肠埃希氏菌进行确认吗亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版?
              按照GB4789.6-2016要求亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,需要先对可疑菌落进行生化鉴定亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,生化鉴定为大肠埃希氏菌后,再进行毒力基因的检测,判定是何种致泻大肠埃希氏菌亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。因为在肠杆菌科中亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,一些致病也存在相同的毒力基因亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,所以不能对可疑菌落直接进行毒力基因检测来判定何种致泻大肠埃希氏菌亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版。

        Q2:如何看待血清型与PCR结果不符的情况亚娱体育最新网址|官方版?
              确实有这情况存在亚娱体育最新网址|官方版,由于血清型判定依据是菌体抗原(O抗原亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版、H抗原亚娱体育最新网址|官方版、K抗原),这些抗原并不是致泻大肠埃希氏菌发病的根本原因,而且相同血清型致泻大肠埃希氏菌中亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,存在不同致病型的大肠埃希氏菌亚娱体育最新网址|官方版,也就是说不同致泻大肠埃希氏菌“共享”同一个血清型亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,这是血清鉴定致泻大肠埃希氏菌的不足之处亚娱体育最新网址|官方版,另外,随着人类对致泻大肠埃希氏菌致病机制的认识亚娱体育最新网址|官方版,并找到引起不同致病型的特征性毒力基因亚娱体育最新网址|官方版,因此亚娱体育最新网址|官方版亚娱体育最新网址|官方版,现行标准以PCR为确认方法,而血清学诊断只是选做项目。

        所需培养基试剂


        用途货号名称规格
        样品制备022010营养肉汤250g/瓶(干粉)
        22010D1营养肉汤225ml/袋
        增菌022160肠道菌增菌肉汤250g/瓶(干粉)
        分离022140麦康凯琼脂培养基250g/瓶(干粉)
        024076麦康凯琼脂培养基90 mm×20块/盒
        022060伊红美蓝琼脂培养基250g/瓶(干粉)
        024087伊红美蓝琼脂培养基90 mm×20块/盒
        生化实验CP0080三糖铁斜面20支/盒
        075240蛋白胨水20支/盒
        029030靛基质试剂10ml/支
        075150尿素20支/盒
        075330氰化钾生长试验管20支/盒
        075340氰化钾对照管20支/盒
        HKI005EasyID致泻大肠埃希氏菌生化鉴定试剂盒10test/盒
        071760致泻大肠埃希氏菌生化鉴定盒8种×10次/盒
        PCR确认KJD02PEPEC-STEC-EHEC多重PCR检测试剂盒24测试/盒
        KJD03PEAEC多重PCR检测试剂盒24测试/盒
        KJD04PETEC多重PCR检测试剂盒24测试/盒
        KJD05PEIEC多重PCR检测试剂盒24测试/盒
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